华山风湿免疫科系统性红斑狼疮研究成果

华山医院风湿免疫科聚焦于经典自身免疫性疾病－系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematous, SLE）的研究及治疗。我们较早在国内开始狼疮患者体内滤泡辅助性T细胞（follicular helper T cell, Tfh）的研究，Tfh细胞是一群以辅助B细胞增殖、分化和抗体分泌为主要功能的T细胞，我们前期研究结果证明SLE中Tfh细胞比例升高，其分泌的IL-21含量增加且与自身抗体滴度和病情活动度密切相关，在SLE的发病中具有重要的作用。同时，我们发现介导抗体产生的B细胞亚群中，一群新发现的调节性B细胞（regulatory B cell, Breg）在SLE中具有重要的负向调节左右，可有效抑制效应性B细胞（effector B cell, Beff）的增值、分化和抗体分泌，而既往在SLE发病机制的研究中未得到重视，尤其Tfh细胞对Breg细胞是否具有调节作用未见报道，我们通过SLE患者的临床研究证实活动期SLE患者中Breg细胞比例增加，其分泌的细胞因子IL-10浓度增加；进一步通过MRL/lpr狼疮鼠动物模型研究其作用机制，结果证明Tfh细胞及其主要分泌的细胞因子IL-21可通过活化STAT3信号通路有效促进Breg细胞的增值、分化及促进IL-10分泌发挥负向免疫调节作用。证明Tfh细胞及其分泌的细胞因子IL-21在SLE发病机制发挥“双刃剑”的重要作用；一方面可促进Beff细胞增值分化及产生抗体导致病情活动，另一方面其也可以通过诱导负向调节的Breg细胞增值、分化、分泌IL-10控制病情活动度，提示：Tfh细胞及IL-21可作为SLE治疗的新靶点。该研究已获得国家自然科学基金（面上项目）1项，已结题。

研究成果：

课题1：滤泡辅助性T细胞对SLE中“效应性/调节性”B细胞的调节机制研究   国家自然科学基金（面上项目）81373213 2014/01-2017/12   70万   主持（邹和建）；
发表文章
1)          Xue Yang, Ji Yang, Yiwei Chu, Jiucun Wang, Ming Guan, Xiaoxia Zhu, Xue Yu, Hejian Zou*. T follicular helper cells mediate expansion of regulatory B cells via IL-21 in lupus-prone MRL/lpr mice. Plos One. 2013,8(4): e62855.
2)          Xue Yang, Ji Yang, Yiwei Chu, Yu Xue, Dandan Xuan, Shucong Zheng, HejianZou*. T follicular helper cells and regulatory B cells dynamics in systemic lupuserythematosus. Plos One. 9(2): e88441,2014.
3)          Xue Yang, Chi liu, Masayuki Fujino , Ji Yang, Xiaokang Li, Hejian Zou*. Amodified graft-versus-host-induced model for systemic sclerosis, with pulmonary fibrosis in Rag2-deficient mice. FEBS Open Bio. 2017,16;7(9):1316-1327.
4)          Xue Yang, Ji Yang，Xiaokang Li, Weizhe Ma, Hejian Zou*. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells inhibit T follicular helper cell in lupus-prone mice. Lupus. 2018, 27(1):49-59.
5)          Lei Han, Xue Yang, Yiyun Yu, Weiguo Wan, Ling Lv , Hejian Zou*. Associations of circulating CXCR3-PD-1+CD4+T cell with disease activity of systemic lupus erythematosus. Mod Rheumatol. 2018,10( 28):1-9.
6)          Ji Yang, Xue Yang, Hejian Zou*, Ming Li*. Oxidative stress and Treg and Th17 dysfunction in systemic lupus erythematosus, Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2016 (2016): 2526174.
7)          韩磊，杨雪，邹和建* 长链非编码RNA在免疫应答中的研究进展，国际免疫学杂志，2017,1(40):84- 87.

此外，基于近年来骨髓间充质干细胞（BM-MSC）在自身免疫性疾病中的治疗潜力，结合我们对系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematous, SLE）中滤泡辅助T淋巴细胞（follicular helper T cell, Tfh）的前期研究，我们建立了B6鼠来源BM-MSC的分离、纯化及培养方法，可获得稳定表型和功能的BM-MSC细胞，操作方法已形成标准化流程，有助于后续试验的开展。借助MRL/lpr狼疮鼠证实BM-MSC可明确抑制CD4+T细胞的增殖，抑制体外Tfh细胞的分化和增殖，并存在剂量依赖关系；BM-MSC能明显抑制Tfh细胞分泌IL-21，明显抑制Tfh细胞中IL-21mRNA的表达，同时也能够抑制Tfh细胞中重要的转录因子Bcl-6、STAT3和p-STAT3的表达。在BM-MSC对Tfh细胞的调节过程中，细胞－细胞接触抑制的作用较细胞因子分泌的抑制作用更为明确。我们进一步将体外培养的BM-MSC通过尾静脉注射输注至MRL/lpr狼疮鼠体内，结果提示BM-MSC输注治疗可明确延长MRL/lpr狼疮鼠的存活率，能明显降低血清中IL-21的含量及外周血中IL-21mRNA的表达、减少MRL/lpr狼疮鼠24小时尿蛋白量，降低MRL/lpr狼疮鼠脾脏Tfh细胞比例、脾脏指数及抗ds-DNA抗体水平。提示：基于Tfh细胞和IL-21的治疗靶点，BM-MSC可作为治疗狼疮的新选择。该研究已获得国家自然科学基金（青年项目）1项，已结题。

课题2：MSC对系统性红斑狼疮中Tfh细胞的调节作用和机制研究   国家自然科学基金（青年项目） 81401346 2015/01-2017/12    23万   主持（杨雪）;
发表文章
1)          Xue Yang, Ji Yang, Xiaokang Li, Weizhe Ma, Hejian Zou*. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells inhibit T follicular helper cell in lupus-prone mice. Lupus.2018, 27(1):49-59.
2)          Ji Yang, Xue Yang, Jie Yang, Ming Li*. Hydroxychloroquine Inhibits the Differentiation of Th17 Cells in Systemic Lupus Erythematosus. J Rheumatol. 2018,45(6):818-826,
3)          Xue Yang, Chi liu, Masayuki Fujino , Ji Yang, Xiaokang Li, Hejian Zou*. A modified graft-versus-host-induced model for systemic sclerosis, with pulmonary fibrosis in Rag2-deficient mice. FEBS Open Bio. 2017,16;7(9):1316-1327.
4)          Ji Yang, Xue Yang, Hejian Zou*, Ming Li*. Oxidative stress and Treg and Th17
dysfunction in systemic lupus erythematosus, Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2016 (2016): 2526174.
5)          Ji Yang, Qiao Li, Xue Yang, Ming Li*. Increased serum level of prolactin is related to autoantibody production in systemic lupus erythematosus, lupus, 2016,25(5): 513-519.
6)          Ji Yang, Qiao Li, Xue Yang, Ming Li*. Interleukin-9 is associated with elevated anti-double-stranded DNA antibodies in lupus-prone mice. Molecular Medicine, 2015, 21:364-370.

基于上述的研究基础，我们进一步聚焦于MSC对Tfh细胞的免疫调节作用及作用机制，2012年两个国际研究小组在Nature Medicine上报道了一群新的T细胞-即滤泡调节性T细胞（Follicular regulatory T cells，Tfr），结合我们的研究，我们意外发现将MSC与CD4+T细胞共培养后，Tfh细胞分化被抑制，而Foxp3+和BCL-6+的T细胞比例增加，即Tfr细胞比例增加，提示MSC 在抑制Tfh细胞的同时促进了Tfr 细胞的分化。同时，我们也将MSC的研究进一步扩展，外泌体（exosome）是MSC分泌的一种重要的免疫调节因子, 大量研究表明MSC 源性外泌体能够模拟MSC的生物学功能，通过配受体结合、膜融合或者内吞作用进入靶细胞，发挥MSC的生物学作用。MSC源性exosome较MSC本身性质更稳定，保存运输更方便，且没有移植细胞带来的免疫排斥反应和肿瘤形成风险。目前，我们研究团队已熟练掌握获取MSC源性exosome的分离方法（包括超速离心及试剂盒提取），以及前期体外Tfh、Treg细胞的分化培养，保证后续试验的顺利开展。现有的研究结果提示MSC来源的exosome可通过膜融合进入Tfh细胞发挥免疫调节作用，MSC来源的exosome可降低共培养上清中Tfh细胞分泌的IL-21含量及抑制转录因子Bcl-6mRNA的表达；同时，MSC源性的exosome可促进CD4+Foxp3+Treg 的分化，同时促进CD4+CXCR5+Foxp3+ Tfr的分化；且经过进一步的高通量筛选，提示与MSC源性exosome共培养后的Tfh细胞中存在明确的差异基因表达及信号通路蛋白表达，目前正在进行具体机制的研究。提示：MSC可能通过分泌的exosome调控Tfh和Tfr的动态平衡，发挥对狼疮的治疗作用。该研究已获得国家自然科学基金（面上项目）1项，在研。

课题3：MSC源性外泌体对系统性红斑狼疮中Tfh/Tfr细胞“漂移”的调控作用和机制研究国家自然科学基金（面上项目） 81871277 2019/01-2022/12   56万，主持（杨雪）;
发表文章
1)          Ji Yang, Xue Yang, Jie Yang, Ming Li *. Baicalin ameliorates lupus autoimmunity by inhibiting differentiation of Tfh cells and inducing expansion of Tfr cells, Cell Death & Disease, 2019,10:140.
2)          向清勇，万伟国，刘佳滟，王令彪，邹和建，杨雪，外泌体在系统性红斑狼疮中的研究进展，中国免疫学杂志（接受待发表）